bài giảng thí nghiệm sinh học phân tử

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử - 6 eppendorf 1.5ml - Các dung dịch I, II, III - RNase, phenol, chloroform, ethanol tuyệt đối, ethanol 70%, TE - Pipetman các loại: 0.5-10ul; 20-100ul; 200-1000ul, đầu tip - Bình đựng nƣớc thải - Máy vortex - Máy li tâm ở nhiệt độ thƣờng và ly tâm lạnh III. Thực hành Sinh viên tiến hành tách chiết plasmid theo các bƣớc nhƣ sau: - Nuôi cấy dòng E. coli mang plasmid pGEM trong 5ml môi trƣờng LB có bổ sung 5ul Amp 50mg/ml, lắc qua đêm ở 37oC. - Hút dịch vi khuẩn vào 3 eppendorf 1.5ml, mỗi eppendorf 1.5ml. Thu sinh khối bằng ly tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dịch bên trên. - Bổ sung 100µl dung dịch 1 vào eppendorf chứa sinh khối; vortex thật kỹ. - Bổ sung 200µl dung dịch 2; đảo nhẹ. Bổ sung ngay 150µl dung dịch 3; đảo nhẹ. - Ly tâm thu dịch nổi ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi từ 3 eppendorf trên vào eppendorf mới, bỏ cặn. - Bổ sung 1.5µl RNase vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi trên ủ ở 37oC trong 1 giờ. - Sau đó, bổ sung vào mỗi eppendorf 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform; vortex nhẹ; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng; thu dịch nổi. - Thêm vào eppendorf trên 500ul ethanol tuyệt đối; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa - Rửa tủa trên với 500ul ethanol 70% lạnh; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, 4 oC. Thu tủa; phơi khô tự nhiên. - Bổ sung 25µl TE; bảo quản mẫu ở 4oC. Chú ý: Phenol, chloroform là những chất oxy hóa mạnh, có khả năng gây bỏng. Tránh tiếp xúc trực tiếp với da, đặc biệt là mắt. trong trƣờng hợp nhỏ lên tay, cần rửa ngay bằng nƣớc. trƣờng hợp bị nặng hơn, cần báo ngay với cán bộ hƣớng dẫn thực hành để kịp thời xử lý. Trang 11 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử BÁO CÁO Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về các bƣớc tách chiết plasmid, giải thích và kết quả thí nghiệm. Câu hỏi: 1. Plasmid là gì? 2. Mục đích của việc tách chiết plasmid? 3. Giải thích các bƣớc của quá trình tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS- kiềm. Trang 12 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử BÀI 4. PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG, CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI GEL AGAROSE MỤC TIÊU: Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng: Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau: - Mục đích của việc xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA - Giá trị của một mẫu DNA đƣợc xem là sạch là nhƣ thế nào - Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang - Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành - Phƣơng pháp điện di trên gel agarose là nhƣ thế nào? - Mục đích của phƣơng pháp điện di gel agrose Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau: - Biết cách sử dụng máy đo mật độ quang - Biết cách phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid cho trƣớc đồng thời biết cách sử dụng enzyme cắt giới hạn thích hợp cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid - Biết cách thu nhận thông tin kiểm chứng về trình tự plasmid mục tiêu - Biết cách đọc, ghi nhận và giải thích kết quả trên bảng điện di gel agarose - Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu Số tiết lên lớp: 10 tiết Bảng phân chia thời lƣợng TT NỘI DUNG SỐ TIẾT 1 Cơ sở lý thuyết 4 2 Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ 1.5 3 Các bƣớc tiến hành 3 4 Nhận xét kết quả thí nghiệm 1,5 Trang 13 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Trọng tâm bài thực hành - Nắm vững phân tích mẫu plasmid bằng các phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di trên gel agarose I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] 1.1. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp đo mật độ quang 1.2. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn 1.3. Phân tích sản phẩm cắt giới hạn bằng điện di gel agarose II. Thực hành II.1. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp đo mật độ quang a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị - Dung dịch DNA plasmid thu đƣợc ở bài 2 - 1 buồng đo - 1 eppedorf 1.5ml - Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip - Nƣớc cất vô trùng - Bình chứa nƣớc thải, giấy thấm - Máy đo mật độ quang b. Thực hành - Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần bằng cách hút 1.5ul dung dịch DNA plasmid thu đƣợc vào 1 eppendorf sạch. Bổ sung 13.5ul nƣớc cất vô trùng. Lắc trộn đều. - Mở máy đo mật độ quang, chọn chƣơng trình đo thích hợp theo hƣớng dẫn của cán bộ. - Rửa sạch buồng đo, điều chỉnh blank - Nạp 10ul mẫu vào buồng đo. Nhấn nút DNA để đo nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch DNA. - Ghi nhận kết quả và rút ra kết luận. II.2. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị Trang 14 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử - Dung dịch DNA plasmid thu đƣợc ở bài 2 - 1 eppedorf 1.5ml - Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip - Nƣớc cất vô trùng - Enzyme cắt giới hạn, dung dịch đệm (buffer) - Bình chứa nƣớc thải, giấy thấm - Tủ ấm 37oC b. Thực hành Dựa vào bản đồ plasmid cho trƣớc (Hình 2), sinh viên thực tập chọn enzyme cắt giới hạn sử dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid. Dự đoán kết quả thu đƣợc khi sử dụng enzyme đã chọn cho phản ứng kiểm chứng. Hình 2. Vùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn (MCS) và bản đồ giới hạn của plasmid pGEM- T Easy [4] Sinh viên tiến hành thực hiện phản ứng cắt giới hạn theo các bƣớc sau:  Chuẩn bị một eppendorf sạch và thiết lập phản ứng cắt với thành phần sau đây: DNA plasmid 1ug Trang 15 Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử Dung dịch đệm (10X) 1ul Enzyme cắt giới hạn 0.5ul Nƣớc cất bổ sung sao cho tổng thể tích phản ứng là 10ul  Ủ hỗn hợp phản ứng này ở 37oC trong 2 giờ hoặc qua đêm II.3. Phân tích sản phẩm cắt giới hạn của plasmid bằng điện di gel agarose a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị - Sản phẩm PCR của bài 1; Dung dịch plasmid đã tách chiết của bài 2; Sản phẩm cắt giới hạn của bài 3 của mỗi nhóm thực tập - Agarose nóng chảy ở nhiệt độ thấp - Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X) - Dung dịch nạp mẫu - Ethidium bromide (10mg/ml) - Pipetman các loại: 0.5 – 10ul, đầu tip - Bộ điện di - Hộp đèn soi UV - Lò vi ba b. Thực hành - Chuẩn bị gel agarose Sinh viên tiến hành đổ gel agarose theo các bƣớc sau: + Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn + Cân 0.5g agarose vào bình erlen 100ml, bổ sung 25ml dung dịch TAE 1X + Đun chảy dung dịch agarose trong lò vi ba; để nguội đến 35-40oC, lắc đều; đổ dung dịch agarose vào khuôn lƣợc + Để nguội cho gel kết đông tự nhiên; sau khi gel đông gỡ 2 gờ của khuôn và tháo lƣợc ra khỏi khuôn + Cho dung dịch TAE 1X vào buồng điện di, đặt miếng gel vào buồng điện di. - Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu Trang 16